2 × Pfu PCR -blandning

Ultrarent Taq DNA-polymeras av hög kvalitet.

Pfu DNA -polymeras uttrycks från E. coli med klonad Pyrococus Furiosis DNA -polymerasgen och renas och separeras genom multipel kolonnrening. Eftersom Pfu har 3'-5'-exonukleasaktivitet kan den korrekturläsa i DNA-amplifieringsprocessen, medan traditionell Taq DNA-polymeras inte kan. Även om andra Taq DNA -polymeraser såsom Vent, Deep Vent, Tli, UITma, etc. har korrekturläsningsfunktioner, har Pfu den lägsta felanpassningsfrekvensen bland alla Taq DNA -polymeraser som hittills hittats. Pfu DNA -polymeras har bättre termisk stabilitet än vanligt Taq DNA -polymeras, och det kan bibehålla mer än 90% aktivitet vid 95 ° C i 1 timme.

Pfu PCR-blandning med ett rör (nationell högteknologisk produktcertifiering)

■ Pfu PCR Mix har förbättrad specificitet och känslighet för PCR -reaktion och kan förstärka komplexa mallar med högt GC -innehåll, sekundär struktur och liknande. Så lågt som 2 kopior av målmallen kan förstärkas, vilket garanterar mer exakta experimentella resultat.

■ Den unika Pfu MasterMix-formeln gör hela reaktionssystemet mycket stabilt och aktiviteten påverkas inte av upprepad frysning eller långvarig lagring vid 4 ° C.

■ Den stabila och effektiva förberedda PCR-blandningslösningen kan göra operationen snabb och enkel, vilket kraftigt minskar arbetsintensiteten och provtagningsfel. Högpresterande PCR-förstärkare och optimerare ingår också i mixen, vilket minskar kraven på PCR-förhållanden.

■ Denna produkt har både färginnehållande och färgfria system. Färginnehållande PCR Mix-produkter kan elektroforeseras direkt efter PCR, utan att tillsätta provbuffert.

Katt. Nej Förpackningsstorlek
4992780 1 ml
4992781 5*1 ml
4992782 1 ml
4992906 5*1 ml

Produktdetalj

Arbetsflöde

Vanliga frågor

Produktetiketter

Aktivitetsdefinition

Aktiviteten hos 1 enhet (U) Pfu DNA-polymeras definieras som den mängd enzym som krävs för att införliva 10 nmol deoxynukleotider i syraolösliga ämnen vid 74 ° C inom 30 minuter med användning av aktiverat lax-spermier-DNA som en mall/primer.

Kvalitetskontroll

Renheten genom SDS-PAGE-detektion är mer än 99%; Ingen aktivitet av exogent nukleas detekteras; Enkopiegen i humant genom kan amplifieras effektivt; Ingen signifikant aktivitetsförändring när den förvaras i rumstemperatur i en vecka.

Huvudsakliga tekniska parametrar

Den har 3'-5'-exonukleasaktivitet och ingen 5'-3'-exonukleasaktivitet. Förlängningshastigheten för DNA-amplifiering är lägre än för Taq-polymeras och i allmänhet är förlängningshastigheten för Pfu-enzym 0,5-1 kb per minut. Den termiska stabiliteten hos Pfu är bättre än Taq. För mallar med högt GC -innehåll kan denatureringstemperaturen ökas till 98 ° C, vilket inte har någon effekt på aktiviteten hos Pfu -polymeras. PCR-produkten är trubbig, som kan tillsättas med 3'-dA-överhäng innan den ligeras med TA-vektor eller klonas med trubbig-ändad vektor

Ansökningar

Det kan användas för förstärkning av DNA, såsom kloning av genuttryck, platsriktad mutation, enkel nukleotidpolymorfism (SNP) -analys och slutreparation.

Alla produkter kan anpassas för ODM/OEM. För detaljer,vänligen klicka på Anpassad tjänst (ODM/OEM)


  • Tidigare:
  • Nästa:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Experimental ExampleExperimental Example Använd genomiskt DNA som mall för att förstärka 1 kb fragment.
    Efter PCR -reaktionen, ta 5 | il för elektroforesdetektering.
    F: Inga förstärkningsband

    A-1 mall

    ■ Mallen innehåller proteinföroreningar eller Taq -hämmare etc. —— Rena DNA -mall, ta bort proteinföroreningar eller extrahera mall -DNA med reningskit.

    ■ Denatureringen av mallen är inte fullständig —— Lämpligt öka denatureringstemperaturen och förläng denatureringstiden.

    ■ Mallnedbrytning —— Förbered mallen igen.

    A-2 Primer

    ■ Dålig kvalitet på primers —— Syntetisera primern igen.

    ■ Nedbrytning av primer —— Dela upp högkoncentrationsprimrarna i liten volym för bevarande. Undvik att frysa och tina flera gånger eller långvarig kryokonservering vid 4 ° C.

    ■ Felaktig design av primers (t.ex. primerlängd inte tillräcklig, dimer bildad mellan primers, etc.) -Design primers (undvik bildning av primer dimer och sekundär struktur)

    A-3 mg2+koncentration

    ■ Mg2+ koncentrationen är för låg —— Rätt öka Mg2+ koncentration: Optimera Mg2+ koncentration genom en serie reaktioner från 1 mM till 3 mM med ett intervall på 0,5 mM för att bestämma den optimala Mg2+ koncentration för varje mall och primer.

    A-4 Glödgningstemperatur

    ■ Den höga glödgningstemperaturen påverkar bindningen av primer och mall. —— Minska glödgningstemperaturen och optimera tillståndet med en lutning på 2 ° C.

    A-5 Förlängningstid

    ■ Kort förlängningstid —— Öka förlängningstiden.

    F: Falskt positivt

    Fenomen: Negativa prover visar också målsekvensbanden.

    A-1 kontaminering av PCR

    ■ Korsförorening av målsekvens eller förstärkningsprodukter —— Försiktigt att inte pipettera provet som innehåller målsekvensen i det negativa provet eller spill ut dem från centrifugröret. Reagensen eller utrustningen bör autoklaveras för att eliminera befintliga nukleinsyror, och förekomsten av kontaminering bör bestämmas genom negativa kontrollförsök.

    ■ Reagenskontaminering ——Använd reagenserna och förvara dem vid låg temperatur.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ koncentrationen är för låg —— Rätt öka Mg2+ koncentration: Optimera Mg2+ koncentration genom en serie reaktioner från 1 mM till 3 mM med ett intervall på 0,5 mM för att bestämma den optimala Mg2+ koncentration för varje mall och primer.

    ■ Felaktig primerdesign och målsekvensen har homologi med icke-målsekvensen. —— Re-design primers.

    F: Ospecifik förstärkning

    Fenomen: PCR-förstärkningsbanden är oförenliga med den förväntade storleken, antingen stora eller små, eller ibland förekommer både specifika förstärkningsband och icke-specifika förstärkningsband.

    A-1 Primer

    ■ Dålig primerspecificitet

    —— Re-design primer.

    ■ Primerkoncentrationen är för hög —— Höj denatureringstemperaturen korrekt och förläng denatureringstiden.

    A-2 mg2+ koncentration

    ■ Mg2+ koncentrationen är för hög ——Sänk korrekt Mg2+ -koncentrationen: Optimera Mg2+ koncentration genom en serie reaktioner från 1 mM till 3 mM med ett intervall på 0,5 mM för att bestämma den optimala Mg2+ koncentration för varje mall och primer.

    A-3 termostabilt polymeras

    ■ Överdriven enzymmängd —— Minska enzymmängden på lämpligt sätt med intervallet 0,5 U.

    A-4 Glödgningstemperatur

    ■ Glödgningstemperaturen är för låg —— Höj glödgningstemperaturen på lämpligt sätt eller använd tvåstegsglödgningsmetoden

    A-5 PCR-cykler

    ■ För många PCR -cykler —— Minska antalet PCR -cykler.

    F: Patchy eller smetband

    A-1 Primer——Dålig specificitet ——Design primern, ändra primerns position och längd för att förbättra dess specificitet; eller utföra kapslad PCR.

    A-2 Mall-DNA

    ——Mallen är inte ren —— Rena mallen eller extrahera DNA med reningssatser.

    A-3 mg2+ koncentration

    ——Mg2+ koncentrationen är för hög —— Minska Mg korrekt2+ koncentration: Optimera Mg2+ koncentration genom en serie reaktioner från 1 mM till 3 mM med ett intervall på 0,5 mM för att bestämma den optimala Mg2+ koncentration för varje mall och primer.

    A-4 dNTP

    —— Koncentrationen av dNTP är för hög —— Minska koncentrationen av dNTP på lämpligt sätt

    A-5 Glödgningstemperatur

    —— För låg glödgningstemperatur —— Lämpligt öka glödgningstemperaturen

    A-6 cykler

    ——För många cykler ——Optimera cykelnumret

    F: Hur mycket mall -DNA ska tillsättas i ett 50 | il PCR -reaktionssystem?
    ytry
    F: Hur förstärker jag långa fragment?

    Det första steget är att välja lämpligt polymeras. Vanligt Taq-polymeras kan inte korrekturläsas på grund av avsaknad av 3'-5'-exonukleasaktivitet, och felanpassning kommer att kraftigt minska förlängningseffektiviteten hos fragment. Därför kan vanligt Taq -polymeras inte effektivt amplifiera målfragment större än 5 kb. Taq -polymeras med speciell modifiering eller annat högfrekvent polymeras bör väljas för att förbättra förlängningseffektiviteten och uppfylla behoven för långfragmentförstärkning. Dessutom kräver amplifieringen av långa fragment också motsvarande justering av primerdesign, denatureringstid, förlängningstid, buffert-pH, etc. Vanligtvis kan primers med 18-24 bp leda till bättre utbyte. För att förhindra mallskador bör denatureringstiden vid 94 ° C reduceras till 30 sekunder eller mindre per cykel, och tiden för att stiga temperaturen till 94 ° C före förstärkning bör vara mindre än 1 min. Dessutom kan inställning av förlängningstemperaturen till cirka 68 ° C och utformning av förlängningstiden enligt hastigheten 1 kb/min säkerställa effektiv förstärkning av långa fragment.

    F: Hur förbättras PCR -förstärkningstrohet?

    Felhastigheten för PCR -amplifiering kan reduceras genom att använda olika DNA -polymeraser med hög trovärdighet. Bland alla Taq -DNA -polymeraser som hittills hittats har Pfu -enzymet lägsta felfrekvens och högsta trovärdighet (se bifogad tabell). Förutom enzymval kan forskare ytterligare minska PCR -mutationshastigheten genom att optimera reaktionsförhållandena, inklusive optimering av buffertkomposition, koncentration av termostabilt polymeras och optimering av PCR -cykelantal.

    Skriv ditt meddelande här och skicka det till oss